Retenu prisonnier dans une commanderie templière moderne qui offre tous les aspects du laboratoire expérimental haut de gamme, Desmond Miles est soumis à une série de tests censés permettre à de mystérieux observateurs de décrypter le précieux héritage dont il est dépositaire, sans le savoir. Grâce à l’ »animus », une machine extrêmement sophistiquée qui permet à ses utilisateurs de visionner le passé en utilisant la mémoire génétique du sujet, on assiste « en direct » aux missions mouvementées d’Aquilus, mercenaire romain du IIIe siècle, d’Altaïr, disciple d’Al Mualim au XIIe siècle, et enfin d’Ezio, l’assassin de la Renaissance, tous étant de lointains ancêtres de Desmond Miles. Défiant le temps et la science, les missions successives de ces générations d’assassins offrent toujours plus de renseignements à leurs adversaires. Grâce à la complicité de Lucy, membre de la secte des assassins infiltrée chez les templiers, Desmond Miles parvient toutefois à échapper à ses geôliers. Au terme de sa fuite, Desmond découvrira que ses « alliés » comptent dans leur rang un certain « patient 16 » dont il vaut mieux se tenir éloigné…

Désormais échappé d'Abstergo grâce à Lucy, Desmond va devoir fuir les Templiers et trouver un repaire sur. Exit Rome, place donc à Monterrigioni, où les Assassins font route vers la demeure d'Ezio. Le trajet étant pour le moins long, Desmond fera plusieurs voyages au sein de l'Animus, et nous retrouverons cette fois le personnage d'Aquilus, un citoyen romain qui luttait déjà contre les ancêtres des Templiers (décidément). Le voyage ne sera pas de tout repos, car dans la réalité, les Assassins tomberont sur plusieurs embuscades. Desmond comprend qu'une taupe se cache parmi leurs rangs et grâce au passé de ses aînés, il parvient à localiser le traitre et l'élimine tout simplement. Arrivé à Monterrigioni, Desmond comprend que l'Animus est en train de changer son comportement et sa personnalité.